La microscopia in campo oscuro è un tipo di microscopia ottica che sfrutta l’illuminazione obliqua per rendere chiaramente visibili campioni non colorati con indici di rifrazione molto vicini a quelli dell’ambiente circostante, difficili da visualizzare con la microscopia in campo chiaro convenzionale per via della differenza ottica trascurabile rispetto al mezzo che li circonda.
Il condensatore per il campo oscuro trasmette esclusivamente raggi obliqui che non sono in grado di entrare nell’obiettivo, a meno che non colpiscano discontinuità ottiche (come la membrana cellulare, il nucleo e gli organelli interni di una cellula) che li riflettano, rifrangano o diffrangano, modificandone l’angolazione tanto da permette loro di raggiungere l’obiettivo. Il campione pertanto apparirà luminoso, mentre nei punti in cui non sono presenti discontinuità ottiche (es. il plasma) i raggi obliqui non colpiranno nulla, si incroceranno senza entrare nell’obiettivo e il campo visivo apparirà scuro.
I condensatori per il campo oscuro possono essere “a secco” o “a immersione”. Con questi ultimi, per potere visualizzare il campione è necessario deporre una goccia di olio per immersione sulla testa del condensatore affinché venga stabilito un contatto tra questa e la parte inferiore del vetrino. Il condensatore per campo scuro ad immersione ha superfici interne a specchio e lascia passare raggi molto obliqui e privi di aberrazione cromatica, producendo risultati migliori e uno sfondo più nero.
La risoluzione delle immagini che si possono ottenere è maggiore rispetto ai condensatori a secco e molto più alta rispetto al campo chiaro, tanto da consentire di visualizzare corpuscoli di dimensioni inferiori a 1 micron.
I candidati ideali per l’illuminazione in campo oscuro includono il sangue, minuscoli organismi acquatici, diatomee, piccoli insetti, ossa, fibre, capelli, batteri non colorati, lieviti e protozoi.
I campioni non biologici includono cristalli, particelle colloidali, campioni di polvere e sezioni sottili di polimeri e ceramiche contenenti piccole inclusioni, differenze di porosità o gradienti di indice di rifrazione.
Quando si preparano i campioni per la microscopia in campo oscuro è necessario prestare attenzione a non introdurre bolle d’aria e contaminanti, per non alterare l’immagine. Anche lo spessore del campione, lo spessore del vetrino e le dimensioni del coprivetrino sono molto importanti, per eliminare la possibilità di artefatti. Il campione di sangue deve consistere in un monostrato di cellule. Lo spessore del vetrino per l’analisi del sangue vivo è di 1,2 mm mentre le dimensioni del coprivetrino vanno da 18×18 a 22×22 mm.